Prácticas Bioquímica: Determinación del factor Rh por PCR

Significado clínico

El factor Rh es una proteína con capacidad antigénica que forma parte de la membrana de los hematíes en el 85% de la población humana. Se han identificado más de 45 antígenos del sistema Rh, pero de todos ellos sólo son frecuentes los D, C y E. El principal antígeno Rh es el D. Si está presente, el individuo es Rh positivo y si está ausente es Rh negativo. La herencia de los antígenos Rh está determinada por un complejo de dos genes, de los cuales uno codifica la proteína responsable del antígeno D y otro codifica la proteína responsable de los antígeno C y E. Las personas Rh positivas poseen genes RhD y RhCE. Por su parte, las Rh negativas tienen únicamente el gen RhCE.

Principio del método

Se determinará el Rh utilizando para ello las técnicas de PCR y electoforesis de ADN. Se aislará ADN de la saliva y se llevará a cabo la reacción de PCR. La base de esta práctica es la amplificación de un fragmento del gen D. La amplificación de este fragmento indicará que a persona es Rh+. Debido a que los genes D y CE son altamente homólogos, es posible diseñar cebadores que se emparejan con una región del gen D y también con una región del gen CE. De esta forma, los individuos Rh+ producirán dos fragmentos de diferentes tamaños (1200 pb y 600 pb) correspondientes a los genes D y CE, mientras que los individuos Rh- producirán un único fragmento (1200 pb) correspondiente al gen CE.

EXTRACCIÓN DEL ADN

Materiales

Reactivo de lisis celular
Reactivo precipitante de proteínas
Reactivo hidratante para el ADN
Isopropanol
Etanol al 70%
Solución salina
Tubos de centrífuga de 15 mL
Tubos para microcentrífuga de 1,5 mL
Microcentrífuga (13000-16000 rpm)
Vórtex
Baño maría
Micropipetas y puntas
Gradillas

Procedimiento

(Nota: Preparar las cantidades de los reactivos en tubos eppendorf para agilizar el proceso)

1. Enjuagarse la boca con 10 mL de solución salina durante 10-20 segundos. Devolver la solución al tubo y centrifugar a 1500-2000 rpm durante 10 minutos.

2. Eliminar el sobrenadante con cuidado y añadir 600 microlitros de reactivo de lisis celular. Pipetear arriba y abajo hasta resuspender las células.

3. Transferir el contenido a un tubo de 1,5 mL e incubar durante 10 minutos a 37ºC en baño maría. Agitar por inversión cada 2 minutos.

4. Añadir 200 microlitros de reactivo precipitante de proteínas al tubo con la muestra y agitar en el vortex durante 20-30 segundos. Centrifugar a 13000-16000 rpm durante 5 minutos.

5. Verter el sobrenadante en un tubo de 1,5 mL con 600 microlitros de isopropanol. Mezclar por inversión unas 40-50 veces. Centrifugar a 13000-16000 rpm durante 2 minutos.

6. Descartar el sobrenadante e invertir el tubo sobre papel absorbente limpio para eliminar restos de líquido. Añadir 600 microlitros de etanol al 70% e invertir el tubo varias veces hasta disolver el pelet.

7. Centrifugar a 13000-16000 rpm durante 1 minuto. Eliminar el etanol con cuidado. Invertir el tubo sobre papel para eliminar el líquido y dejar secar al aire durante 5-10 minutos.

8. Añadir 200 microlitros de reactivo hidratante para el ADN y resuspender el pellet mediante pipeteo arriba y abajo. Almacenar en el refrigerador o a -20ºC si se va a almacenar durante períodos más largos.

AMPLIFICACIÓN POR PCR

Materiales

Mix PCR
Control positivo
Agua destilada
Tubos de 0,2 mL
Micropipetas y puntas
Termociclador

Procedimiento

1. Marcar los tubos como "C+", "C-", "M1", "M2", etc, y dispensar:

C+: 22,5 microlitros mix PCR + 2,5 microlitros control positivo

C-: 22,5 microlitros mix PCR + 2,5 microlitros agua destilada

M: 22,5 microlitros mix PCR + 2,5 microlitros de ADN

2. Pasar los tubos al termociclador, que previamente ha sido progamado:

10 minutos a 95ºC
35 ciclos:

1 minuto a 95ºC
1 minuto a 64ºC
1 minuto a 72ºC

10 minutos a 72ºC

ELECTROFORESIS

Materiales

Tampón TBE
Agarosa
Colorante SYBR-green
Marcador de Pm (escalera de ADN)
Tampón de carga
Cubeta de electoforesis
Fuente de alimentación
Transiluminador
Sistema de captación de geles
Tubos de 0,2 ml
Recipientes de vidrio
Microondas
Micropipetas y puntas
Gradillas

Procedimiento

1. Preparar el tampón TBE:

Tris-base: 54 g
EDTA: 3,75 g
Ácido bórico: 27,5 gramos
Enrasamos hasta 1L y con ayuda de un imán disolvemos los reactivos.

2. Preparar el gel de agarosa:

4 g de agarosa + 200 mL tampón TBE.
Mezclar e introducir en el microondas hasta ebullición.
Enfriar en baño maría hasta que la agarosa llega a 65ºC
Añadimos 16 microlitros de SYBR-green.
Verter la solución en un molde de la cubeta de electroforesis y dejar enfriar.
Retirar los peines y los topes de sellado y cubrir de tampón TBE.

3. Marcar un tubo de 0,2 ml como "Pm" y poner en él 12 microlitros de marcador de Pm más 3 microlitros de tampón de carga. Mezclar bién y cargar el primer pocillo. Con una punta nueva cargar todo el contenido de cada tubo "M", "C+" y "C-".