Inmunodoting

Significado clínico

El análisis de inmunoglobulina mide el nivel de ciertas inmunoglobulinas, o anticuerpos, en la sangre. Los anticuerpos son proteínas producidas por el sistema inmunológico para atacar a los antígenos, como las bacterias, los virus y los alérgenos.
En esta práctica vamos a medir la presencia o ausencia de IgG bovinas en varias problemas de suero mediante un ensayo de inmunodot.

Principio del método

En el ensayo se utiliza una membrana de nitrocelulosa, sobre la que se fija el antígeno. Posteriormente se añade sobre la membrana el anticuerpo que reconoce específicamente a ese antígeno. Este anticuerpo tiene unida una enzima que al añadir su sustrato generará un producto coloreado.
Se denomina "inmunodot"  a aquella técnica inmunoenzimática que se realiza sobre una membrana.

Materiales

• Placas de análisis (nitrocelulosa).
• Anticuerpo anti-IgG bovina conjugado con peroxidasa.
• Ovoalbúmina.
• Tampón fosfato salino.
• Sustrato/Cromógeno.
• Cubeta de incubación, coloración y lavado (en este caso una placa de Petri).
• Pipetas automáticas.
• Frasco lavador.
• Control positivo (suero sanguíneo bovino).
• Control negativo (suero sanguíneo ovino).
• Muestras de suero (M1, M2 y M3).
• Agua destilada.

Procedimiento

1. Colocar la placa sobre una superficie NO ABSORBENTE con los pocillos hacia arriba.

2. Aplicar en el centro de cada pocillo de la placa 5 microlitros de las muestras y controles y dejar que se seque al aire.

3. Cubrimos los pocillos con solución de bloqueo y esperamos 30 minutos.

4. Retirar la solución y lavar con abundante agua destilada. IMPORTANTE: A partir de este paso nunca dejar que la placa se seque hasta el final.

5. A cada pocillo le añadimos 20 microlitros del anticuerpo conjugado con peroxidasa e incubar 10 minutos a temperatura ambiente. Lavar cada pocillo con agua destilada.

6. Inmediatamente añadir en cada pocillo 50 microlitros de sustrato/cromógeno. Lo dejamos actuar unos minutos mientras movemos suavemente la solución. Detener la reacción cuando las señales de los controles positivos sean claras, lavando con abundante agua. Dejar que la membrana se seque completamente.

Resultados

M1: +

M2: -

M3: +