El análisis de inmunoglobulina mide el nivel de ciertas inmunoglobulinas, o anticuerpos, en la sangre. Los anticuerpos son proteínas producidas por el sistema inmunológico para atacar a los antígenos, como las bacterias, los virus y los alérgenos.
En esta práctica vamos a medir IgG de un suero de procedencia bovina.
Principio del método
La inmunodifusión radial es una técnica que permite la cuantificación de antígenos. El antígeno se aplica sobre unos pocillos practicados en geles de agarosa que contienen una concentración determinada del antisuero específico. El antígeno que se quiere medir difunde a través del gel y se combina con el antisuero hasta alcanzar la zona de equivalencia. En este punto aparecen precipitados Ag-Ac en forma de círculo alrededor del pocillo. El diámetro del círculo es proporcional a la concentración de antígeno.
Materiales
- Placas de Petri pequeñas.
- Tampón de inmunodifusión radial.
- Disolución de lavado.
- Disolución colorante.
- Disolución decolorante.
- Suero anti-IgG bovina.
- Patrones de IgG.
- Muesta.
- Agarosa.
- Micropipetas.
- Agua destilada.
- Pipetas Pasteur.
- Papel de filtro.
- Cámara húmeda.
- Algodón.
- Estufa.
- Pinzas.
Procedimiento
1. Preparamos la agarosa al 1,5% (p/v): 100 mL tampón + 1,5 g de agar. Lo calentamos en el microondas hasta que este hierva y se transparente.
2. Lo introducimos en el baño maría y cuando la temperatura descienda hasta 50-53ºC añadimos el antisuero al 1% (v/v) y mezclamos bien.
3. Antes de que se enfríe más y se solidifique lo emplacamos echando en cada placa 8 mL. Lo dejamos enfríar.
4. Cuando ya haya solidificado con la ayuda de una pipeta Pasteur y un patrón hacemos 6 pocillos.
5. Aplicamos las muestras y los patrones en cada pocillo sin olvidarnos primero de marcar donde irá cada uno de ellos, pero nunca lo haremos sobre la base de la placa porque nos impedirá la visión del precipitado.
6. En una placa de Petri más grande creamos una cámara húmeda humedeciendo un trozo de algodón con agua destilada. Introducimos nuestra placa con la muestra allí y la cerramos. Incubamos durante 24 horas a temperatura ambiente.
7. Tras la incubación, aplicamos con la ayuda de una pipeta pasteur solución de lavado hasta cubrir la superficie. La dejamos 2 minutos, tras lo cual lavamos de nuevo y movemos la placa para agilizar el lavado.
8. Tras el lavado cortamos un trozo de papel de filtro y lo humedecemos con agua destilada y lo aplicamos sobre el gel. Cortamos varios trozos de papel más y las ponemos por encima del anterior, pero esta vez sin humedecerlos. Le aplicamos un peso por encima para que el papel vaya absorbiendo todo el agua que quede en el gel durante 10 minutos, tras los cuales lo llevamos al horno hasta que esté totalmente seco y transparentado.
9. Le añadimos el colorante y lo dejamos actuar 10 minutos.
10. Añadimos solución decolorante y dejamos actuar 2 minutos. Lo desechamos y volvemos a añadir solución decolorante otra vez.
11. Por último lavamos con solución de lavado y de inmediato la desechamos. Dejamos secar a temperatura ambiente y posteriormente medimos el diámetro de los círculos formados.
Resultados
- Patrón 1 = 13 mm ; 0'4 mg / dL
- Patrón 2 = 11 mm ; 0,2 mg / dL
- Patrón 3 = 6 mm ; 0'1 mg / dL
- Muestra 1 = 8 mm ; 0'12 mg / dL
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