Las proteínas son compuestos orgánicos macromoleculares, ampliamente distribuidos en el organismo. Actúan como elementos estructurales y de transporte. Se dividen en dos fracciones, albúminas y globulinas.
Su determinación es útil en la detección de:
- Hiperproteinemia producida por hemoconcentración, deshidratación o aumento en la concentración de proteínas específicas.
- Hipoproteinemia por hemodilución debida a un defecto en la síntesis proteica, pérdidas excesivas o catabolismo proteico excesivo.
Principio del método
Las proteínas son moléculas anfóteras y en medio básico adquieren una carga global negativa que hace que migren del cátodo hacia en ánodo cuando son sometidas a un proceso electroforético.
Materiales
- Equipo de electroforesis: fuente eléctrica,, cubeta, aplicador.
- Tiras de acetato de celulosa.
- Láminas Mylar.
- Papel de filtro.
- Colorante rojo Ponceau.
- Decolorante: ácido cítrico.
- Solución transparentadora.
- Solución disolvente: ácido acético al 80%.
Procedimiento
1. Introducimos las tiras 100mL de buffer y las dejamos durante 10 minutos mientras movemos la cubeta ligeramente. Cuando hayan pasado los 10 minutos las sacamos y las ponemos entre dos papeles de filtro para retirar el exceso de tampón.
2. Colocamos las tiras en el puente con la cara absorbente hacia arriba (el borde cortado debe ir abajo y a la derecha).
3. Llenamos completamente la cubeta de electroforesis en un lado e inclinamos para que el tampón pase al otro lado y queden a la misma altura. Introducimos el puente y comprobamos que las tiras tocan el tampón en los dos lados, si no es así añadir más buffer.
4. Aplicamos las muestras en un lado del puente y conectamos los cables. Hay que conectar el cable negro en el lado de aplicación de la muestra ya que esta va desde el polo negativo al positivo y el otro cable al otro lado. Seleccionar el voltaje a 200v y dejar que la muestra migre.
5. Apagar el equipo y extraer las tiras. Metemos las tiras en el colorante rojo Ponceau durante 5 minutos y las ponemos encima de un agitador para que el colorante penetre mejor.
6. Al sacarlas del colorante las llevamos a las cubetas con la solución decolorante. Aplicamos 2 baños de decolorante hasta que las tiras quedan con el fondo blanco.
7. Tras la decoloración, metemos las tiras en una cubeta con solución transparentadora durante 1 minuto.
8. Colocamos la tira sobre un Mylar film y con la ayuda de una varilla de vidrio lo extendemos para evitar pompas y eliminar el exceso de líquido. Cortamos los bordes sobrantes y metemos las tiras en la estufa a 80ºC durante 10 minutos.
9. Cuando esté completamente seca la cortamos en tiras y la llevamos al fotodensitómetro para que se trace el proteinograma.
Resultados
área total = 335
área pico albúmina = 135
%albúmina = (135*100)/335 = 40,29 %
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