Triglicéridos

Significado clínico

Los triglicéridos son grasas que suministran energía a la célula. Al igual que el colesterol, son transportados a las células del organismo por las lipoproteínas de la sangre. Una dieta alta en grasas saturadas o carbohidratos puede elevar los niveles de triglicéridos puede elevar los niveles de triglicéridos. Su aumento es relativamente inespecífico. Diversas dolencias, como ciertas disfunciones hepáticas (cirrosis, hepatitis, obstrucción biliar) o diabetes mellitus pueden estar asociadas con su elevación.

Principio del método

Los triglicéridos incubados con lipoproteinasa (LPL) liberan glicerol y ácidos grasos libres. El glicerol es fosforilado por glicerolfosfato deshidrogenasa (GPO) y ATP en presencia de glicerol quinasa (GK) para producir glicerol-3-fosfato (G3P) y adenosina-5-difosfato (DAP) y peróxido de hidrógeno por GPO.
Al final, el peróxido de hidrógeno reacciona con 4-aminotenazona (4-AF) y p-clorofenol, reacción catalizada por la peroxidasa (POD) dando una coloración roja.
La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de triglicéridos presentes en la muestra ensayada.

Materiales

• Tubos de ensayo
• Cubetas de espectrofotómetro
• Gradillas
• Pipetas automáticas
• RT
• TRIGLICERIDOS CAL (200 mg/dL)
• Suero
• Espectrofotómetro
• Baño maría
  
  
  
  
  
  
  

Procedimiento

1. Añadir en tres tubos:

Blanco: 1,0 mL RT

Patrón: 1,0 mL RT + 10 microlitros patrón

Muestra: 1,0 mL RT + 10 microlitros muestra

2. Mezclar e incubar 5 minutos a 37ºC en el baño maria.

3. Leer la absorbancia a 505 nm en un espectrofotómetro.

Resultados

Patrón: 0,697 A

Muestra: 0,317 A

Concentración triglicéridos = (0,317A/0,697A)*200 mg/dL= 90,96 mg/dL

Colesterol

Significado clínico

El colesterol es una sustancia grasa presente en todas las células del organismo. El hígado produce naturalmente todo el colesterol que necesita para formar las membranas celulares y producir ciertas hormonas. La determinación del colesterol es una de las herramientas más importantes para el diagnóstico y clasificación de las lipemias. El aumento del nivel de colesterol es uno de los principales factores de riesgo cardiovascular.

Principio del método

La intensidad del color formado es proporcional a la concentración de colesterol presente en la muestra.

Materiales

• RT (R1+R2)
• CHOLESTEROL CAL
• Pipetas automáticas
• Tubos de ensayo
• Cubetas de espectrofotómetro
• Gradillas para tubos y para cubetas
• Espectrofotómetro
• Baño maría
• Muestra

Procedimiento

1. Pipeteamos en tres tubos:

Blanco: 1,0 mL RT

Patrón: 1,0 mL RT + 10 microlitros cholesterol cal

Muestra: 1,0 mL RT + 10 microlitros muestra

2. Mezclar e incubar 5 minutos a 37ºC.

3. Leer la absorbancia del patrón y de la muestra a 505 nm en el espectrofotómetro.

Resultados

Patrón= 0,719 A

Muestra= 0,641 A

Concentración colesterol= (0,641/0,719)*200= 178,30 mg/dL

Medición del pH con pHmetro

Principio del método y significado clínico

Los pH-metros son utilizados en los LDC para medir el pH de los líquidos biológicos, así como para medir y ajustar a pH de tampones y reactivos. Funcionan por métodos potenciométricos galvánicos.

Materiales

• pHmetro
• Calibradores pH=7 y pH=4
• Orina
• Frasco lavador
• Recipiente para lavar 

Procedimiento

1. Encendemos el pHmetro y le quitamos la protección. Lavamos el electrodo y quitamos el exceso de líquido pero sin secar totalmente el electrodo. Le damos a la tecla con forma de botella y luego a la tecla pH. Ahora tomamos el calibrador pH 7 e insertamos el electrodo y la sonda CAT dentro de él. Esperamos que la temperatura se estabilice y le damos a la tecla con forma de botellita. Repetimos el proceso con el calibrador pH 4.

2. Ahora por último procedemos a medir el pH de la orina. Insertamos el electrodo y la sonda CAT en el frasco con orina y esperamos a que se estabilice la temperatura. A continuación le damos a la tecla pH y en la pantalla nos dará el resultado.

Resultados

pH orina = 5,87

Identificación de proteínas por inmunoelectroforesis

Significado clínico

Separar las proteínas contenidas en un suero e identificar en él la posible presencia de Albúmina e IgG.

Principio del método

La inmunoelectroforesis es una técnica de separación e identificación de sustancias que atraviesa dos fases. Durante la primera fase, separamos las proteínas de la muestra mediante una electroforesis convencional en agarosa. En la segunda fase, se practica un carril o canal paralelo al recorrido electroforético y se rellena con un Ac antiproteína adecuado. La difusión del Ag y del Ac permitirá que ambos se unan y reacciones entre sí formando un complejo Ag-Ac que se hará visible en forma de unos arcos de precipitación.

Materiales

• IgG
• Suero sanguíneo
• Albúmina
• Anticuerpos frente al suero
• Anticuerpos frente a la IgG
• Polvo de agarosa
• Tampón de electroforesis
• Papel de filtro
• Pajitas para perforar los pocillos
• Placas de petri
• Pipetas 
• Matraz

Procedimiento

1. Preparamos el tampón: 980 mL agua destilada + 20 mL contenido del bote de tampón
2. Preparamos la agarosa: 3 g agar + 200 mL tampón. Calentamos la mezcla a 100ºC en el microondas y cuando haya transparentado lo sacamos y lo metemos en baño maría hasta que alcance 60ºC.

3. Construimos un molde con una placa de petri y cuatro portaobjetos para los carriles. Echamos la agarosa en la bandeja molde y antes de que solidifique añadimos el molde para los carriles y lo dejamos solidificar. Una vez sólido el agar retiramos los moldes y hacemos los pocillos para las muestras.

4. Colocamos la bandeja con el gel en la cubeta de electroforesis y ponemos papel de filtro en cada uno de sus extremos de manera que sobresalga hacia el exterior. Esos papeles deben estar empapados en tampón. Vertemos tampón en cada uno de los vasos de la cubeta de electroforesis hasta llenarlos y asegurándonos que los extremos de los papeles están sumergidos en en tampón.

5. Dispensamos en los pocillos 20 microlitros de cada antígeno:

• en el de arriba -> IgG
• en el central -> Suero completo
• en el de abajo -> Albúmina

6. Cerramos la tapa de la cubeta y ponemos el voltaje a 125V durante 30 minutos. (IMPORTANTE: Cerca de la zona de aplicación polo negativo.)

7. Al acabar la electroforesis añadimos los anticuerpos. 60 microlitros en cada carril:

• carril de arriba: Ac Anti-IgG
• carril de abajo: Ac Antisuero

8. Tras 24-48 horas de difusión, serán visibles los arcos de precipitación en el gel.

Extracción "casera" de ADN

Significado clínico

La extracción del ADN de las células donde se haya confinado es un paso previo en muchos procedimientos analíticos y diagnósticos.

Principio del método

La extracción del ADN de una muestra celular se basa en el hecho de que los iones salinos son atraídos hacia las cargas negativas del ADN, permitiendo su disolución y posterior extracción de la célula. Se empieza por lisas las células mediante un detergente, vaciándose su contenido molecular en una disolución tampón en la que se disuelve el ADN. En ese momento, el tampón contiene ADN y todo un surtido de restos celulares: ARN, carbohidratos, proteínas y otras sustancias en menor proporción. Las proteínas asociadas al ADN , de gran longitud, se habrán fraccionado en cadenas más pequeñas y separado de él por acción del detergente. Sólo queda, por tanto, extraer el ADN de esa mezcla de tampón y detergente, para lo cual se utiliza alcohol etílico.

Materiales

• Muestra vegetal
• Agua
• Sal de mesa
• Bicarbonato sódico
• Detergente líquido o champú
• Alcohol etílico frío
• Batidora
• Nevera
• Colador o centrífuga
• Vaso
• Tubo de ensayo
• Varilla fina

Procedimiento

1. Preparamos el tampón:

120 mL agua destilada + 1,5g sal de mesa + 5g bicarbonato sódico +5 mL detergente líquido

2. Cortar las verduras y triturarlas con un poco de agua en la batidora, accionando las cuchillas a impulsos de 10 segundos.

3. En un recipiente limpio mezclar 5 mL del triturado con 10 mL del tampón frío y agitar vigorosamente durante 2 minutos.

4. Separar los restos de verduras colando la muestra por unas gasas o por un colador muy fino.

5. Retirar 5 mL del caldo molecular a un tubo de ensayo y añadir con una pipeta 10 mL de alcohol frío. Se debe dejar escurrir lentamente el alcohol por la cara interna del recipiente, teniendo este inclinado. El alcohol quedará flotando sobre el tampón.

6. En un tubo de ensayo limpio echamos 2 mL de alcohol frío y con una pipeta Pasteur cogemos el ADN flotante y lo añadimos.

Resultados

El producto filamentoso obtenido de la extracción no es ADN puro ya que, entremezclado con él, hay fragmentos de ARN. Una extracción "profesional" se realiza añadiendo enzimas que fragmentan las moléculas de ARN e impiden que se unan al ADN.

Electroforesis de proteínas plasmáticas

Significado clínico

Las proteínas son compuestos orgánicos macromoleculares, ampliamente distribuidos en el organismo. Actúan como elementos estructurales y de transporte. Se dividen en dos fracciones, albúminas y globulinas.
Su determinación es útil en la detección de:
- Hiperproteinemia producida por hemoconcentración, deshidratación o aumento en la concentración de proteínas específicas.
- Hipoproteinemia por hemodilución debida a un defecto en la síntesis proteica, pérdidas excesivas o catabolismo proteico excesivo.

Principio del método

Las proteínas son moléculas anfóteras y en medio básico adquieren una carga global negativa que hace que migren del cátodo hacia en ánodo cuando son sometidas a un proceso electroforético.

Materiales

• Equipo de electroforesis: fuente eléctrica,, cubeta, aplicador.
• Tiras de acetato de celulosa.
• Láminas Mylar.
• Papel de filtro.
• Colorante rojo Ponceau.
• Decolorante: ácido cítrico.
• Solución transparentadora.
• Solución disolvente: ácido acético al 80%.

Procedimiento

1. Introducimos las tiras 100mL de buffer y las dejamos durante 10 minutos mientras movemos la cubeta ligeramente. Cuando hayan pasado los 10 minutos las sacamos y las ponemos entre dos papeles de filtro para retirar el exceso de tampón.

2. Colocamos las tiras en el puente con la cara absorbente hacia arriba (el borde cortado debe ir abajo y a la derecha).

3. Llenamos completamente la cubeta de electroforesis en un lado e inclinamos para que el tampón pase al otro lado y queden a la misma altura. Introducimos el puente y comprobamos que las tiras tocan el tampón en los dos lados, si no es así añadir más buffer. 

4. Aplicamos las muestras en un lado del puente y conectamos los cables. Hay que conectar el cable negro en el lado de aplicación de la muestra ya que esta va desde el polo negativo al positivo y el otro cable al otro lado. Seleccionar el voltaje a 200v y dejar que la muestra migre.

5. Apagar el equipo y extraer las tiras. Metemos las tiras en el colorante rojo Ponceau durante 5 minutos y las ponemos encima de un agitador para que el colorante penetre mejor.

6. Al sacarlas del colorante las llevamos a las cubetas con la solución decolorante. Aplicamos 2 baños de decolorante hasta que las tiras quedan con el fondo blanco.

7. Tras la decoloración, metemos las tiras en una cubeta con solución transparentadora durante 1 minuto.

8. Colocamos la tira sobre un Mylar film y con la ayuda de una varilla de vidrio lo extendemos para evitar pompas y eliminar el exceso de líquido. Cortamos los bordes sobrantes y metemos las tiras en la estufa a 80ºC durante 10 minutos. 

9. Cuando esté completamente seca la cortamos en tiras y la llevamos al fotodensitómetro para que se trace el proteinograma.

Resultados

área total = 335

área pico albúmina = 135

%albúmina = (135*100)/335 = 40,29 %