Cromatografía en capa fina

Significado clínico

Hay enfermedades clínicas en las que se produce una alta concentración de aminoácidos en el plasma y en la orina. Este desequilibrio en la sangre se denomina aminoaciduria. Algunas de estas enfermedades son: fenilcetonuria, cistinuria o la enfermedad de Hartnup.

Principio del método

Uno de los análisis empleados para la detección de aminoácidos en una muestra biológica es la cromatografía de capa fina. Es una técnica de separación e identificación de sustancias químicas disueltas en un disolvente (fase móvil) que se mueve sobre una capa delgada de un adsorbente idóneo (fase estacionaria).

Materiales

Preparación del patrón

• Láminas de gel de celulosa.
• Disolvente de cromatografía.
• Disolución reveladora: Ninhidrina en acetona al 0,2% (p/v).
• Muestra problema de aminoácidos.
• Muestra patrón de aminoácidos: triptófano, alanina, valina y arginina.
• Cubeta o tarro de cristal.
• Micropipeta.

Materiales

Procedimiento

1. Tomamos una placa de 10x5 cm y marcamos a 1,5 cm una línea con lápiz. A continuación hacemos varios puntos correspondiente a los dos aminoácidos y otro punto para el patrón. IMPORTANTE: manipular con cuidado y con guantes, ya que la piel tiene aminoácidos y podríamos manchar la placa.

2. Con la placa en horizontal aplicamos 2 microlitros de cada muestra y patrón en sus puntos correspondientes.

3. Añadimos la parte móvil en un recipiente sin que llegue a la línea de puntos. 

4. Una vez secada la muestra introducimos la placa de forma vertical en un recipiente. Los puntos de aplicación de la muestra deben quedar en la base.

5. Esperamos que la parte móvil suba por capilaridad por la placa hasta 2 cm de la parte superior. Marcamos con un lápiz hasta donde ha subido y metemos la placa en la estufa para que se seque rápidamente.

6. A continuación pulverizamos la disolución reveladora sujetando la placa en posición vertical. La pulverización debe hacerse suave y uniformemente. Debe hacerse en una campana extractora o cerca de una ventana porque debe evitarse la inhalación del pulverizado.

7. Calentamos las pacas 2 minutos en la estufa a 105ºC y observamos las manchas de aminoácidos que aparecerán distribuidas a lo largo del gel.

Resultados

La relación al frente del solvente (Rf) va a ser constante y por tanto nos permite, mediante la comparación con patrones, la identificación de la sustancia en una mezcla.

Rf (M1)= 3cm/5cm= 0,60 -> Esta Rf se corresponde con el aminoácido VALINA.

Rf(M2)= 4,2 cm/5cm= 0,84 -> Esta Rf se corresponde con el aminoácido TRIPTÓFANO.